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研究冻融对绵羊精子ATP酶活性的影响

时间:2020-04-24 14:44来源:未知 编辑:美高梅官方网站 点击:
摘要:为了充分发挥和提高优良种公羊的利用率,提高绵羊冻融精液品质,试验采用酶动力学分光度法对冷冻保存前后小尾寒羊精子和精清中ATP酶活性变化进行研究。说明冻融过程对绵羊精子中ATP酶的活性造成了严重损伤。绵羊冻融精子ATP酶的活性可以在一定程度上预测精子活率,并可作为绵羊精液品质评价的重要指标。美高梅官方网站

1材料与方法

1.1主要试剂

甘油、D-(+)-葡萄糖、蔗糖、青霉素、链霉素,柠檬酸钠、氯化钠、0.2%TritonX-100、Tris-HCl缓冲液(0.1mol/L,pH值8.2)、ATP溶液,分析纯。

1.2主要仪器

高速离心机(型号为ZONKIAHC–2518),紫外可见分光光度计(型号为TU-1810PC/SPC),显微镜(型号为CKX31)。

1.3稀释液的配制

取基础液(葡萄糖3g,蔗糖4g,柠檬酸钠3g,超纯水100mL,煮沸消毒)80mL,加20mL新鲜卵黄液,青霉素、链霉素各10万IU配制成保存稀释液;再取上述溶液94mL加入甘油6mL,配制成冷冻稀释液。

1.4精液采集与常规品质评定

选取膘情中等、体质健康、性欲旺盛的小尾寒羊种公羊,用假阴道法采集精液,马上在37℃下进行常规品质评定,要求原精液密度达到“密”级,活率在0.8以上,无异常气味,色泽乳白,用于试验。

1.5 精液冷冻保存与解冻

1.5.1 精液的稀释与平衡精液常规检查后,将符合要求的新鲜精液根据活率和密度按3~6倍的比例,在35℃下用冷冻稀释液等温稀释,混匀,在室温下用0.25mL的塑料细管进行分装并封口。裹8~10层纱布置于4℃冰箱中平衡2~3h。

1.5.2 精液的冷冻与保存将平衡好的精液细管置于自制冷冻漂浮器上(距离液氮表面2.0~2.5cm,温度在-110~-80℃)熏蒸10min,投入液氮保存。

1.5.3 精液的解冻从液氮罐中取出精液细管,迅速浸入39~40℃水浴中,轻轻摇动直至融化(10~15s)。

1.6 精子活率的评定将稀释精液摇匀后,取中层精液10μL滴于经37℃恒温板等温预热的载玻片上,盖片后置于显微镜下放大400倍检查精子1000个以上,分别计算呈直线运动精子数和总精子数,计算精子活率。

1.7 ATP酶活性的测定

1.7.1 ATP酶的提取精液总ATP酶粗提液:取120μL稀释精液于离心管中,加入360μL0.2%TritonX-100,抽提20min,然后4000r/min离心30min,保留上清液待测。精清中ATP酶粗提液:取120μL稀释精液于离心管中,加入自制稀释液360μL2000r/min离心20min,保留上清液待测。精子中ATP酶粗提液:将上一步所得沉淀加入0.2%TritonX-100360μL抽提20min,4000r/min离心30min,保留上清液待测。

1.7.2 ATP酶活性的测定取纯化水2.21mL,ATP溶液1.10mL,混匀后加入25℃预热的ATP酶待测液0.19mL(空白管用纯化水代替),迅速摇匀倒入比色皿(光径为1cm),700nm处每隔1min测定1次OD值,每次测5min。

1.7.3 ATP酶活性的计算公式为:酶活力=(测定管OD值-对照管OD值)×1/(60×取样量)×样品稀释倍数。美高梅官方网站

1.8 数据的统计与分析采用SPSS10.0统计App对试验数据进行统计分析,差异显著性采用ExcelApp中数据分析工具库进行描述统计、t检验和方差分析。试验重复5次以上。

2.结果与分析

结果见表1。由表1可见,与冷冻前相比,冷冻后小尾寒羊精子中ATP酶活性极显著降低(P<0.01),精清中ATP酶活性极显著升高(P<0.01),说明冷冻保存对绵羊精子中ATP酶的活性造成了严重损伤。冷冻前后精子活率与精子ATP酶活性均呈极显著正相关(r=0.979和0.968,P<0.01),说明精子ATP酶活性能够反映精子活率,可作为精液品质评价的指标。
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